關(guān)鍵詞

SARS-CoV-2；高關(guān)注變異株；穩(wěn)定性；消毒效果；人體皮膚；存活時間；感染控制；接觸傳播

 

摘要

我們分析了SARS-CoV-2武漢株系和所有高關(guān)注變異株（VOCs）之間的病毒環(huán)境穩(wěn)定性差異。在塑料和皮膚表面，Alpha、Beta、Delta和Omicron變異株的存活時間比武漢株系長兩倍以上，且在皮膚表面的傳染性持續(xù)超過16小時。這些高關(guān)注變異株的高環(huán)境穩(wěn)定性可能會增加接觸傳播的風險，導致進一步病毒擴散。

 

引言

2020年至2021年以來，各種SARS-CoV-2變異株相繼出現(xiàn)。特別是歸類為“高關(guān)注變異株”的SARS-eoV-2變異株，會造成重大人員、經(jīng)濟損失。因此，了解各變異株的特點對感染控制至關(guān)重要。據(jù)報道，高關(guān)注變異株具有較高的傳染性和傳播性（1）。特別是Omicron（Pango譜系：B.1.1.529）變異株的快速傳播，截至2022年已成為全球關(guān)注的嚴重問題（2，3）。傳染性/傳播性增加可歸因于多種因素，如感染者散播病毒載量增加、病毒散播期延長、造成感染所需的最低病毒載量降低、感染靶部位改變、環(huán)境穩(wěn)定性增加等(4，5)。

有研究者比較了SARS-CoV-2與SARS-CoV-1、流感病毒等其他病毒的環(huán)境穩(wěn)定性（6，7）。此外，之前的研究還表明，Alpha（Pango譜系：B.1.1.7）和Beta（Pango譜系：B.1.351）變異株具有同等程度的環(huán)境穩(wěn)定性(8，9)。然而，對于包括Omicron和Delta（Pango譜系：B.1.617.2）在內(nèi)的所有高關(guān)注變異株之間的病毒穩(wěn)定性差異，目前尚未有研究進行詳細評價和比較。本研究改進了之前開發(fā)的評價模型，精確分析了武漢株系（Pango譜系：A）與所有高關(guān)注變異株在病毒穩(wěn)定性和消毒效果方面的差異。

 

材料與方法 病毒和細胞

本研究中分析的SARS-CoV-2變異株包括武漢株系（Pango譜系：A，hCoV-19/Japan/TY/WK-521/2019）、Alpha變異株（Pango譜系：B.l.1.7，hCoV-19/Japan/QK002/2020）、Beta變異株（Pango譜系：B.1.351，hCoV-19/Japan/TY8-612/2021）、Gamma變異株（Pango譜系：P.l，hCoV-19/Japan/TY7-501/2021）、Delta變異株（Pango譜系：B.l.617.2，hCoV-19/Japan/TYll-927/2021）和Omicron變異株（Pango譜系：B.l.1.529, hCoV-19/Japan/TY38-873/2021）。所有病毒均由日本國立傳染病研究所（National Institute of Infectious Diseases，日本東京）慷慨提供。自日本JCRB細胞保藏中心（Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank，日本大阪）購入表達跨膜絲氨酸蛋白酶TMPRSS2的VeroE6/TMPRSS2細胞，并將其在添加了5%胎牛血清和G418（Nacalai Tesque，日本京都）的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM；Sigma Aldrich）中培養(yǎng)，進行病毒培養(yǎng)與定量(10，11)。按如下步驟進行病毒濃縮和純化：感染后96小時，收獲培養(yǎng)基，并在4℃、2500×g條件下離心10分鐘，消除細胞碎片。使用Beckman SW28轉(zhuǎn)子，在4℃、27000 rpm條件下，磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、20%(w/w)蔗糖墊超速離心2.5小時，沉淀上清液中的病毒粒子（12，13）。在VeroE6/TMPRSS2細胞中以半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)測定病毒滴度。接種三天后，在顯微鏡下對各孔細胞病變效應進行評分，并計算TCID50。

 

評價病毒穩(wěn)定性和消毒效果所用皮膚模型的構(gòu)建

從京都府立醫(yī)科大學法醫(yī)學系獲取的法醫(yī)尸檢標本中采集人體皮膚。將死亡后約1天獲取的20-70歲受試者的腹部皮膚尸檢標本切成尺寸約為4 cm×8 cm的方塊。如受試者皮膚因灼燒或溺水嚴重受損，則不予采集。采用皮膚尸檢標本開發(fā)離體模型，用以評價不同病毒在人體皮膚表面的穩(wěn)定性以及不同消毒劑對人體皮膚表面病毒的消毒效果（6，14）。用PBS清洗去除脂膜的皮膚，將其置于培養(yǎng)池（Corning，美國紐約）中，并放置在孔徑為8.0 μm的膜上。將培養(yǎng)池置于含1.0 mL DMEM（Sigma-Aldrich）的六孔板中。

 

塑料表面和人體皮膚表面病毒穩(wěn)定性評價

對塑料（聚苯乙烯板）表面和人體皮膚（構(gòu)建的皮膚模型）表面的病毒存活情況進行評價。將病毒溶液（5.0×104 TCID50/2 μL PBS）涂于塑料或人體皮膚表面。每份樣本在受控條件下（25℃，45-55% RH）孵育0-120小時，而后收集表面殘留的病毒于1.0 mL DMEM培養(yǎng)基中并滴定（6）。表面殘留病毒滴度的檢測限為100.5TCID50。病毒存活時間定義為表面無法檢測出病毒的時間。每種條件進行三次獨立實驗。表面殘留病毒滴度結(jié)果以平均值±均值標準誤表示。

 

醇基消毒劑消毒效果評價

對不同濃度的醇基消毒劑進行消毒效果評價。對濃度分別為80%、60%、50%、40%、35%、32.5%、30%、27.5%、25%、22.5%和20%（w/w）的乙醇產(chǎn)品（EA，Nacalai Tesque）進行消毒效果檢測。對濃度為70%（w/w）的異丙醇（IPA，Nacalai Tesque）進行檢測。

首先，對消毒劑的消毒效果進行體外評價。將5 μL含病毒的PBS（5.0×104 TCID50/5 μL PBS）在1500 μL的試管中與45 μL各種消毒劑混合15秒。隨后，用450 μL DMEM培養(yǎng)基中和所得溶液，并測定殘留病毒滴度（14）。病毒滴度的檢測限為100.2TCID50。

而后，用已構(gòu)建的模型評價消毒劑對人體皮膚表面病毒的消毒效果（離體評價）。將每種病毒溶液（1.0×105 TCID50/2 uL PBS）涂于人體皮膚表面。然后將每份皮膚樣本在25℃、45%-55%RH條件下孵育15分鐘，使皮膚表面的病毒混合物完全干燥。隨后，將18 μL消毒劑涂于每份皮膚樣本表面15秒，然后風干5分鐘。干燥后，用1000 μL DMEM回收皮膚表面的殘留病毒，并測定殘留病毒載量（14）。病毒滴度的檢測限為100.5TCID50。為測定每種條件下消毒劑的消毒效果，計算病毒滴度的對數(shù)減少值，歸一化為PBS對照滴度。每種條件進行三次獨立實驗，實驗結(jié)果以平均值±均值標準誤表示。

 

倫理考量

本研究方案，包括樣本采集程序，已獲得京都府立醫(yī)科大學倫理委員會審核批準（ERB-C-1593），且已獲得所有研究參與者書面知情同意。

 

統(tǒng)計分析

使用GraphPad Prism 7（GraphPad,Inc.,La Jolla,CA,USA）進行數(shù)據(jù)分析。經(jīng)過的時間定義為解釋變量（X軸），對數(shù)病毒滴度定義為被解釋變量（Y軸）。使用對數(shù)連結(jié)函數(shù)進行線性回歸分析，創(chuàng)建回歸曲線。SARS-CoV-2滴度的測定限為100.5 TCID50；因此，病毒的存活時間定義為回歸曲線Y值為0.5時的X值。當表面殘留病毒滴度為2.0和3.0 log10TCID50時，根據(jù)每條回歸曲線的斜率計算半衰期(6，12)。

 

結(jié)果

測量塑料表面或人體皮膚表面殘留病毒滴度隨時間的變化情況（如補充圖Sl），并通過回歸分析根據(jù)這些滴度值計算存活時間和半衰期（如補充圖S2）。在塑料表面分析中，武漢株系、Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron變異株的存活時間分別為56.0小時（95%置信區(qū)間[Cl]，39.0-76.7小時）、191.3小時（95%CI，152.5-232.1小時）、156.6 小時(95%CI，122.7-192.9小時)、59.3小時(95%CI，43.9-77.7小時)、114.0小時（95%CI，91.3-139.1小時）和193.5小時(95%CI，153.1-236.2小時)（如圖lA和補充表S1所示）。在人體皮膚表面分析中，武漢株系、Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron變異株的存活時間分別為8.6小時（95%Cl，6.5-10.9小時）、19.6小時（95%CI，14.8-25.3小時）、19.1小時(95%CI，13.9-25.3小時)、11.0小時(95%CI，8.1-14.7小時)、16.8小時（95%CI，13.1-21.1小時）和21.1小時(95%CI，15.8-27.6小時)（如圖lB和補充表S1所示）。Alpha、Beta、Delta和Omicron變異株的存活時間顯著長于武漢株系；Omicron變異株的存活時間最長。此外，半衰期顯示出與存活時間相同的趨勢（如圖1C、1D和補充表S2所示）。

體外消毒效果評價顯示，武漢株系和Gamma變異株在32.5%EA作用下15秒內(nèi)完全滅活（對數(shù)減少值＞4），Alpha、Beta和Delta變異株在35%EA作用下15秒內(nèi)完全滅活，Omicron變異株在40%EA作用下15秒內(nèi)完全滅活（如圖2A和補充表S3所示）。因此，Alpha、Beta、Delta和Omicron變異株對乙醇的抗性略高于武漢株系。然而，在人體皮膚表面進行的離體評價顯示，所有病毒均在暴露于35%EA中15秒后實現(xiàn)完全滅活（對數(shù)減少值＞4；如圖2B和補充表S4所示）。

 

討論

2020年，有多項研究(6，7，15)報告了武漢株系的環(huán)境穩(wěn)定性。此外，一些研究表明，Alpha和Beta變異株具有同等程度的環(huán)境穩(wěn)定性(8，9)。然而，尚無研究直接比較其他高關(guān)注變異株與武漢株系，武漢株系與所有高關(guān)注變異株（包括Omicron和Delta 變異株）在環(huán)境穩(wěn)定性方面的差異尚未可知。

本研究顯示，在塑料和皮膚表面，Alpha、Beta、Delta和Omicron變異株的存活時間比武漢株系長兩倍以上，且在皮膚表面的傳染性持續(xù)超過16小時。這些高關(guān)注變異株的高環(huán)境穩(wěn)定性可能會增加接觸傳播的風險，導致高關(guān)注變異株進一步擴散。此外，該分析還顯示，Alpha和Beta變異株在存活時間方面無顯著差異，環(huán)境穩(wěn)定性相似，這一結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致(8,9)。

隨著全球感染人數(shù)的迅速增加，Omicron變異株成為目前人們主要關(guān)注的問題。Omicron變異株傳播迅速，其潛在因素可能在于感染靶部位從下呼吸道轉(zhuǎn)移至上呼吸道以及該變異株的中和抗體逃逸機制(1-5)。本研究表明，在諸多高關(guān)注變異株中，Omicron變異株的環(huán)境穩(wěn)定性最高，這表明，這種高穩(wěn)定性也可能是導致Omicron變異株取代Delta變異株并迅速傳播的原因之一。???

盡管Alpha、Beta、Delta和Omicron變異株在環(huán)境穩(wěn)定性增加的情況下乙醇抗性也略微增加，但皮膚表面所有高關(guān)注變異株均可在暴露于35%EA中15秒后完全失活。因此，按照世界衛(wèi)生組織的提議，強烈建議使用具有適當EA濃度的消毒劑（＞52 w/w%或＞60 v/v%）作為當前的感染控制（手部衛(wèi)生）手段（16，17）。

本研究存在三個局限性。首先，現(xiàn)階段尚不知曉Alpha、Beta、Delta和Omicron變異株環(huán)境穩(wěn)定性較高的原因所在，使用重組病毒進行評價可能能夠找出決定這一點的各項因素。其次，此次環(huán)境穩(wěn)定性評價中獲得的存活時間和半衰期可能受外部環(huán)境和含病毒體液組成變化的影響。本研究為準確分析各高關(guān)注變異株之間的穩(wěn)定性差異，采用了超速離心法純化靶病毒，并以PBS作為溶劑。第三，現(xiàn)階段尚不明確表面殘留病毒量與傳播風險之間的關(guān)系。因此，將本研究中的存活時間值理解為一項參考值可能更為合理。

綜上所述，本研究闡明了各高關(guān)注變異株的環(huán)境穩(wěn)定性，為感染控制提供了重要參考信息。此外，結(jié)合遺傳分析，這些研究結(jié)果將有助于闡明高關(guān)注變異株的傳播機制。

圖1病毒在塑料和皮膚表面的存活時間和半衰期（A、C）

各種病毒在塑料表面的存活時間（A）和半衰期（C）(B、D)各種病毒在人體皮膚表面的存活時間（B）和半衰期（D）存活時間指表面無法檢測出病毒的時間。圖中所有半衰期均指皮膚表面殘留1×102或1×103TCID50（半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量）病毒時的半衰期。數(shù)據(jù)以中位數(shù)±95%置信區(qū)間表示。

圖2.消毒效果評價研究進行了體外評價（A）和離體評價（B），并根據(jù)每次醇基消毒劑暴露后的殘留病毒滴度計算對數(shù)減少值（見補充表S3和S4）。結(jié)果以平均值±標準誤表示。EA，乙醇；IPA，異丙醇。

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