目的

消毒劑對(duì)HPV的殺滅效果如何，到目前為止，我們知之甚少。HPV可能是人類(lèi)性接觸傳播的病菌中最常見(jiàn)的病菌。HPV感染是宮頸癌和肛門(mén)癌的主要原因，同時(shí)也是口咽部癌癥的原兇之一。除了性傳播，垂直傳播和非性接觸傳播也是HPV的重要傳播方式。

方法

用人工合成的HPV16準(zhǔn)病毒顆粒和真正的從人上皮細(xì)胞組織中培養(yǎng)出來(lái)的HPV病毒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，我們用消毒劑對(duì)HPV進(jìn)行了殺滅測(cè)試，以了解消毒劑對(duì)HPV的殺滅效果。有致病力的病毒株置于11種待測(cè)試的消毒劑中一段時(shí)間后往消毒劑中加入中和劑中止消毒劑的消毒作用，然后離心過(guò)濾。檢測(cè)被消毒劑處理過(guò)的病毒的滴度，與未被處理過(guò)的病毒的滴度進(jìn)行對(duì)比。

結(jié)果

HPV16型對(duì)消毒劑有非常高的抵抗力，其對(duì)消毒劑的抵抗力比之前測(cè)試的大部分無(wú)胞膜病毒對(duì)消毒劑的抵抗力還強(qiáng)。準(zhǔn)病毒顆粒對(duì)消毒劑的抵抗力與真實(shí)病毒顆粒對(duì)消毒劑的抵抗力一樣高，但準(zhǔn)病毒顆粒對(duì)異丙醇、苯酚和過(guò)氧乙酸復(fù)合銀離子等消毒劑敏感，真實(shí)病毒和準(zhǔn)病毒均對(duì)戊二醛和鄰苯二甲醛不敏感，但都對(duì)次氯酸鹽和高濃度過(guò)氧乙酸復(fù)合銀離子敏感。

結(jié)論

我們首次對(duì)HPV16天然病毒進(jìn)行了消毒劑敏感性研究，結(jié)果顯示這些臨床常用的消毒劑（甚至滅菌劑）對(duì)HPV16型病毒的殺滅效果不理想，這些消毒劑常用于醫(yī)療機(jī)構(gòu)和牙科診所的醫(yī)療器材的消毒（滅菌）。我們需要政策指引如何使用合適的消毒劑殺滅HPV。因HPV16型對(duì)消毒劑有超常的抵抗力，所以這一點(diǎn)可能可以解釋為什么污染物對(duì)環(huán)境的污染可能會(huì)導(dǎo)致HPV的傳播和通過(guò)非性接觸傳播。

介紹

因HPV生長(zhǎng)周期的特殊性，一直以來(lái)，很難在實(shí)驗(yàn)室中對(duì)培育出具有感染性的HPV并用于實(shí)驗(yàn)，直至近期才解決這個(gè)問(wèn)題。在動(dòng)物體外進(jìn)行培育具有感染性HPV的技術(shù)對(duì)基礎(chǔ)研究非常有益。我們需要的是省時(shí)省力省錢(qián)的方法。

HPV的生命周期與已分化的上皮組織密切相關(guān)。一直以來(lái)，因?yàn)楹茈y在體外培育出具有高滴度的有感染性的HPV病毒，所以無(wú)法在體外對(duì)HPV進(jìn)行消毒劑敏感性檢測(cè)，所以我們不了解消毒劑對(duì)HPV的消毒效果。人類(lèi)已經(jīng)對(duì)很多病毒進(jìn)行了消毒劑的殺滅檢測(cè)，這些檢測(cè)結(jié)果給了醫(yī)療機(jī)構(gòu)相關(guān)的信息，對(duì)控制醫(yī)療相關(guān)感染、控制病毒的傳播和控制再感染起了很大的作用。目前，醫(yī)院和醫(yī)療研究部門(mén)使用消毒劑對(duì)HPV進(jìn)行殺滅，缺乏相關(guān)的資料，只是從消毒劑可殺滅其它的病毒來(lái)選擇，或者只是想當(dāng)然認(rèn)為消毒劑對(duì)HPV有效就使用?，F(xiàn)在培育有兩種系統(tǒng)方法可培育足量的HPV病毒用于科研，一種是利用人工重組合成，另一種方法是在體外進(jìn)行器官培育?，F(xiàn)在可通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄定量PCR的方法對(duì)有感染性的病毒進(jìn)行滴度檢測(cè)。因HPV導(dǎo)致的癌癥，有60%是由HPV16型所引起的，所以最初進(jìn)行的HPV相關(guān)的實(shí)驗(yàn)對(duì)象就是HPV16型。

通過(guò)病毒樣顆粒技術(shù)、準(zhǔn)病毒技術(shù)和器官培育病毒三大技術(shù)，可以得到實(shí)驗(yàn)用的高濃度HPV。有了這些技術(shù)支持，我們成功的進(jìn)行了第一個(gè)關(guān)于常用消毒劑對(duì)HPV16的消毒效果的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示這些消毒劑甚至是滅菌劑，對(duì)HPV16的消毒效果并不理想。HPV16型對(duì)消毒劑有非常高的抵抗力，其對(duì)消毒劑的抵抗力比之前測(cè)試的大部分無(wú)胞膜病毒對(duì)消毒劑的抵抗力還強(qiáng)。我們需要政策指引如何使用合適的消毒劑殺滅HPV。因HPV16型對(duì)消毒劑有超常的抵抗力，所以這一點(diǎn)可能可以解釋為什么污染物對(duì)環(huán)境的污染可能會(huì)導(dǎo)致HPV的傳播和通過(guò)非性接觸傳播。

方法

器官培育病毒

從新生兒包皮環(huán)切組織標(biāo)分離出包皮角質(zhì)形成細(xì)胞(HFKs)，這個(gè)實(shí)驗(yàn)所用的HFKs得到兩個(gè)部門(mén)的認(rèn)可，一是賓夕法尼亞州立大學(xué)醫(yī)學(xué)院審查委員會(huì)，另一個(gè)部門(mén)是Pinnacle健康醫(yī)院機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)。丟棄的、未識(shí)別的組織無(wú)需患者知情同意。兩個(gè)機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)都放棄了知情同意。將全長(zhǎng)HPV16電穿孔至低傳代HFK單層培養(yǎng)，選擇穩(wěn)定維持HPV16基因組的角質(zhì)形成細(xì)胞系進(jìn)行有機(jī)型培養(yǎng)。將被HPV16感染的HFK細(xì)胞接種于含有J2和3T3細(xì)胞的鼠尾型-1膠原基質(zhì)。在上皮細(xì)胞生長(zhǎng)至融合后，這些基質(zhì)被轉(zhuǎn)移到不銹鋼網(wǎng)格上建立液-氣界面。然后用擴(kuò)散法繼續(xù)培養(yǎng)接種物。培養(yǎng)的上皮細(xì)胞被分化，然后收獲，收集組織并儲(chǔ)存進(jìn)行病毒顆粒分離。

準(zhǔn)病毒

用Buck等人所述方法產(chǎn)生準(zhǔn)病毒。293TT細(xì)胞系，已知表達(dá)高水平SV40大T抗原，與遺傳密碼修飾的HPV16衣殼基因L1和L2共轉(zhuǎn)染HPV16。HPV16衣殼基因質(zhì)粒含有SV40來(lái)源的復(fù)制進(jìn)行表達(dá)。48 小時(shí)后，取細(xì)胞進(jìn)行病毒顆粒分離。

病毒顆粒分離

取0.6 mL冰涼1 M NaCl/0.05 M 磷酸鈉緩沖液，用7.5 mL勻漿機(jī)勻漿培養(yǎng)組織和293TT細(xì)胞。用1 M NaCl/0.05 M n磷酸鈉緩沖液200 mL, pH 8，均勻洗滌2次。溶液在4攝氏度用10500轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心10min，上清液轉(zhuǎn)入1.8 mL Nalgene冷凍瓶。原始病毒儲(chǔ)存在-20攝氏度。

消毒測(cè)試

此消毒劑測(cè)試中所用的消毒劑有乙醇（(Fisher Scientific)）、異丙醇（Sigma–Aldrich）、戊二醛（強(qiáng)生）、鄰苯二甲醛（強(qiáng)生）、苯酚（CiDecon; Decon Labs）、過(guò)氧乙酸復(fù)合銀離子（STERIPLEX SD and STERIPLEX SD Pluss;sBioMed）和次氯酸鹽（Activate; Deardorff Fitzsimmons Corp）。

按廠家說(shuō)明書(shū)準(zhǔn)備消毒劑，使用前按要求稀釋?zhuān)唧w濃度見(jiàn)表1。室溫下把病毒與消毒劑混合，作用45分鐘后加入合適的中和劑中止消毒劑的消毒作用。醛類(lèi)消毒劑所用的中和劑是7%的甘氨酸；過(guò)氧乙酸復(fù)合銀離子消毒劑的中和劑是0.1%吐溫80、1%蛋白胨、1%半胱氨酸和0.5M氨丁三醇緩沖劑，pH7.5；其它的消毒劑所用中和劑與過(guò)氧乙酸所用中和劑相同。溶液在超濾膜離心機(jī)中以4000離心10分鐘，超濾膜的分子量設(shè)定為10000。然后再加入中和劑再以同樣轉(zhuǎn)速再一次離10分鐘。在HaCaT培養(yǎng)基中加入加入兩份沖洗液。檢測(cè)液中含有已經(jīng)處理的有感染性的病毒。

表1 各種消毒劑作用45分鐘對(duì)HPV的殺滅效果

實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次取平均值

結(jié)果

表1所示為實(shí)驗(yàn)所用消毒劑。酒精入選的原因是因?yàn)樵谌粘Ｉ罴搬t(yī)療環(huán)境下，酒精常用于手部消毒及環(huán)境消毒，使用廣泛。有研究顯示生殖系統(tǒng)感染了HPV的病人手指上有高濃度HPV，我們想了解酒精對(duì)HPV是否有效以便確定能否用于此類(lèi)感染者。戊二醛做為高水平消毒劑和滅菌劑在醫(yī)療機(jī)構(gòu)和牙科診所使用廣泛而入選，鄰苯二甲醛做為高水平消毒劑入選。其它消毒劑也因?yàn)槠鋸V泛使用而入選。

只有0.525%次氯酸鹽和1.2%過(guò)氧乙酸銀離子對(duì)原始病毒有效，其降低的對(duì)數(shù)值分別為4.862和5.150，殺滅率大于99.99%。其它消毒劑則完全無(wú)殺滅作用，詳見(jiàn)表1。

對(duì)比兩種不同方法得到的原始病毒，器官培育法耗時(shí)耗力費(fèi)用高，而重組方法得到原始病毒的方法更省時(shí)省力省費(fèi)用，然而，在器官培育中培育出來(lái)的病毒，組織的分化伴隨而來(lái)在層狀組織中發(fā)生的生理?xiàng)l件與通常被HPV16感染的粘膜中發(fā)現(xiàn)的情況更為相似。我們?cè)噲D研究HPV16準(zhǔn)病毒與HPV16原始病毒在消毒劑敏感性方面是否存在差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示準(zhǔn)病毒對(duì)消毒劑的敏感性要高于原始病毒，異丙醇對(duì)原始病毒無(wú)效，但卻對(duì)準(zhǔn)病毒有效。有趣的是，戊二醛和鄰苯二甲醛對(duì)病毒均無(wú)殺滅作用。我們把戊二醛的作用時(shí)間延長(zhǎng)到48小時(shí)，依然沒(méi)有殺滅作用（未附上數(shù)據(jù)）。醛類(lèi)的消毒機(jī)制之一是病毒衣殼蛋白中重要賴氨酸殘基的交聯(lián)。這些衣殼修飾的下游效應(yīng)可能包括抑制病毒進(jìn)入病毒基因組的脫殼和運(yùn)輸?shù)秸_的細(xì)胞間隔，這是啟動(dòng)病毒程序所必需的。醛類(lèi)也能有效地使核酸變性，這表明如果病毒衣殼的完整性受到損害，病毒DNA或RNA也可能被滅活。Knappe等人發(fā)現(xiàn)L1衣殼蛋白中存在賴氨酸殘基，對(duì)高效感染具有重要意義。牛乳頭瘤病毒的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)也表明，賴氨酸殘基位于L1蛋白的入侵臂上，這可能對(duì)五聚體的完整性很重要。雖然準(zhǔn)病毒粒子和來(lái)自器官培育的病毒對(duì)某些消毒劑的敏感性不同，但它們對(duì)醛類(lèi)的共同抗性導(dǎo)致了這樣一種假設(shè)，即這些殘留物要么不可接近，要么沒(méi)有表現(xiàn)出交聯(lián)所需的適當(dāng)空間分離。這一共性表明這兩種病毒粒子在結(jié)構(gòu)上有一些相似之處。對(duì)這兩種病毒顆粒類(lèi)型都有效的消毒劑是1.2%的過(guò)氧乙酸銀離子和次氯酸鹽，這兩種消毒劑劑都是強(qiáng)氧化劑，表明以氧化為基礎(chǔ)的消毒劑可能對(duì)滅活HPV有效。

在使用戊二醛和鄰苯二甲醛時(shí)，經(jīng)常會(huì)延長(zhǎng)作用時(shí)間，所以我們把這兩種消毒劑的作用時(shí)間延長(zhǎng)到24小時(shí)，以觀察對(duì)原始病毒的殺滅效果。結(jié)果顯示延長(zhǎng)作用時(shí)間，依然對(duì)HPV無(wú)效。

對(duì)中和劑也進(jìn)行了檢測(cè)，對(duì)病毒無(wú)殺滅作用，證明中和劑的選擇是正確的。表1與圖1的檢測(cè)均進(jìn)行5次然后取平均值，表2的檢測(cè)進(jìn)行了6次然后取平均值。由于這些結(jié)果對(duì)于醫(yī)院獲得性感染和醫(yī)源性獲得性感染的重要性，所有的研究都是由不同的研究人員在兩個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行的，使用了多批病毒和細(xì)胞。

討論

到目前為止，這是第一個(gè)被證實(shí)的對(duì)戊二醛滅活抵抗的病毒。由于戊二醛對(duì)其他微生物病原體的殺滅作用范圍廣，在許多臨床情況下都是首選的消毒劑。它已被證明對(duì)包括腺病毒、細(xì)小病毒、杯狀病毒和許多腸病毒在內(nèi)的多數(shù)無(wú)包膜病毒有效。除了對(duì)戊二醛和鄰苯二甲醛的耐藥外，HPV16與其他高度耐藥的無(wú)包膜病毒如杯狀病毒和細(xì)小病毒有許多相似之處。這些病毒都對(duì)高濃度次氯酸鹽較為敏感，在一項(xiàng)研究中，細(xì)小病毒對(duì)過(guò)氧乙酸-銀離子消毒劑以及過(guò)氧乙酸也都敏感。一般來(lái)說(shuō)，無(wú)包膜病毒對(duì)酒精類(lèi)消毒劑都有中度或完全的抵抗性，在這個(gè)研究中，HPV16也確實(shí)對(duì)酒精高度抵抗。

有研究表明，HPV存在非性傳播途徑。有研究評(píng)估了嬰兒與母親在HPV方面的一致性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在HPV檢測(cè)陽(yáng)性的母親群體，有小比率的嬰兒HPV檢測(cè)也陽(yáng)性。有趣的是，有兩個(gè)嬰兒HPV檢測(cè)陽(yáng)性，但其母親HPV檢測(cè)卻是陰性。為了提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性，避免實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)的污染，在嬰兒出生時(shí)即采樣并且在獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行PCR檢測(cè)。這些發(fā)現(xiàn)表明，在臨床環(huán)境中確實(shí)存在感染HPV的風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)合我們的消毒劑實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可以想象，目前使用的許多消毒劑可能無(wú)法有效消除醫(yī)院感染中的HPV。對(duì)沒(méi)有性生活史的女性的患病率進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了不同的結(jié)果。Kjaer等人對(duì)一組處女進(jìn)行了為期2年的跟蹤研究，在研究開(kāi)始時(shí)，所有處女的VLP HPV16均為DNA陰性，血清學(xué)檢測(cè)也為陰性。只有那些在研究過(guò)程中開(kāi)始的性生活的女性被發(fā)現(xiàn)具有可檢測(cè)到的HPV16 DNA和/或血清轉(zhuǎn)化。Tay et al. 15通過(guò)陰道鏡和組織學(xué)檢查確定了HPV感染的發(fā)生，發(fā)現(xiàn)在他們的研究中，50%的處女陰道鏡下有HPV感染的證據(jù)，同時(shí)對(duì)這50%的群體進(jìn)行組織學(xué)檢查確診，80%有HPV感染。

這些研究中發(fā)現(xiàn)的差異可能是由于檢測(cè)方法、樣本量、地理位置甚至患者轉(zhuǎn)診過(guò)程的不同造成的。這些方法和設(shè)計(jì)上的變化是常見(jiàn)的，通常會(huì)導(dǎo)致無(wú)法解釋HPV感染的自然史方面的結(jié)論。我們的數(shù)據(jù)支持了HPV感染相關(guān)傳播、自體接種和醫(yī)院傳播的可能性，即使是被認(rèn)為是“無(wú)菌”的儀器設(shè)備，也存在HPV污染的風(fēng)險(xiǎn)。由于天然HPV16已被證明對(duì)化學(xué)消毒劑具有很強(qiáng)的抵抗性，特別是對(duì)手消毒劑和儀器消毒經(jīng)常使用的消毒劑，因此有必要制定新的感染控制措施已應(yīng)對(duì)HPV導(dǎo)致的感染風(fēng)險(xiǎn)。常規(guī)消毒和衛(wèi)生可能不足以清除HPV的可能來(lái)源，因此在感染活動(dòng)性病毒的人群中，再次感染的風(fēng)險(xiǎn)可能會(huì)增加。此外，我們的數(shù)據(jù)顯示，準(zhǔn)病毒粒子和類(lèi)似粒子可能無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)量消毒劑對(duì)HPV的有效性。

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